ELISA技术的“自我认知”

有临
2021.07.16
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ELISA是酶联免疫吸附实验( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。


原理:测定时,受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与溶液中的其他物质分开,再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应结合在固相载体上,加入酶反应的底物后,底物被酶催化成有色产物,产物的量与标本中要检测的目标物质的量直接相关,故可根据颜色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的灵敏度。主要从以下几个部分介绍:


一、各种不同的ELISA检测类型


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二、ELISA不同研究领域的应用


ELISA技术是特定靶标蛋白质定量的金标准,提供快速、稳定且易于分析的结果。ELISA可用于研究领域中的许多靶标:


1)细胞因子、趋化因子和生长因子:细胞因子(cytokine,CK)是细胞经刺激活化后,分泌的一类具有高活性的小分子蛋白质,细胞因子是介导细胞间信息传递,参与免疫细胞分化发育、免疫应答、免疫调节及炎症反应的重要免疫分子。


细胞因子不仅与免疫状况和炎症反应有关,而且还与神经退行性疾病和癌症等疾病有关。可准确定量血清、血浆和组织培养上清液中的细胞因子,从而使研究人员能够充分了解生理条件下疾病的发病机制。



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2)肿瘤免疫学:许多药物的研究策略都是针对免疫检查点标记物来增强抗肿瘤的免疫性。免疫检查点是维持正常免疫反应和保护组织免受免疫激活损伤的重要细胞途径。癌细胞免疫检查点失调,并将其用作免疫抵抗的机制。例如,PD-1使癌细胞免受T细胞识别,从而防止了T细胞的攻击;CTLA-4在抗原提呈细胞引发T细胞的过程中发挥作用,抗体阻断CTLA-4受体可激活T细胞,从而产生抗癌免疫反应。


3)神经生物学:ELISA能够定量多种生物学来源的蛋白质,包括多种物种的血清,血浆和CSF(脑脊液)。


- 淀粉样蛋白β(Aβ,β淀粉样蛋白或Abeta):与阿尔茨海默病有关,是阿尔茨海默病患者大脑中淀粉样斑块的主要成分。


- Tau:是一种稳定的微管蛋白,如果不能正常发挥功能,则可能与神经系统的病理和痴呆有关。


- α突触核蛋白(α-突触核蛋白):在维持突触前末端突触小泡的供应中起重要作用,也可能有助于调节多巴胺的释放。


4)磷酸特异性:真核细胞中大约30%的蛋白经过磷酸化修饰,调控细胞活性,包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯。而异常的磷酸化状态涉及许多人类疾病,包括癌症。研究关键蛋白质靶标的磷酸化和翻译后修饰对于更好地了解疾病背后的机制至关重要。其中ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法,为研究信号通路中涉及的细胞内蛋白的研究人员提供了有力支持。


针对各种疾病(包括STAT3,CREB,PRAS40,p38,AMPK alpha,PTK2,Caspase 3信号传导)涉及的许多关键靶标和信号传导途径的磷酸化进行准确、灵敏和快速的定性、定量分析。


5) 免疫球蛋白: 免疫球蛋白是指具有抗体活性的动物蛋白,主要存在于血浆中,也见于其他体液、组织和一些分泌液中。


对于一些疾病的研究,比如系统性红斑狼疮:多见于 lgG、lgA、IgM 的升高;类风湿性关节炎:多见于 IgG、IgM 的升高;巨球蛋白血症:产生 IgM 的浆细胞恶性增生,血清中IgM可高达20g/L以上;IgE升高:常见于超敏反应性疾病,如过敏性鼻炎、外源性哮喘、枯草热、慢性荨麻疹,以及寄生虫感染、急慢性肝炎、药物所致的间质性肺炎、支气管肺曲菌病、类风湿性关节炎等。



三、ELISA法的使用目的


ELISA方法按照使用目的可以分为两类。第一类:生物大分子的定量,如抗体的稳转、瞬和发酵过程的表达量监控,细胞因子的监控,体内抗体药物的药代动力学,药效生物标志物的含量检测和免疫原性测定等;第二类:亲和力测定评价或者筛选。如杂交瘤的滴度测定,噬菌体展示的淘选筛选,体外抗体和对应靶点蛋白或细胞表面受体的亲和力评价等。


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采用相同的实验材料,不同的试剂配比以分别达到生物大分子定量和亲和力评价的使用目的并进行对比的研究。抗体定量的目的是使所测的抗体样品尽可能被捕捉到,从而进行准确的定量,而抗体结合活性检测的目的是需要有完整的上下渐进线,S型曲线,其测得EC50即亲和力数值(解离平衡常数)。



四、如何开展ELISA检测?


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五、ELISA方法的检验标准


1)生物大分子定量方法学验证


大分子的方法验证主要根据现行的指导原则的要求进行方法验证,验证包括但不仅限于校正曲线、特异性(基质效应)/选择性、准确度(批内、批间)、精密度(批内、批间)、耐用性、稳定性、线性、范围、稀释线性/钩状效应、定量限(灵敏度)、平行性等内容。


2)亲和力测定验证(相对结合活性方法学验证)


亲和力指得是抗体和靶点抗原的解离平衡常数,是一个非常重要的生物特性。在质量控制过程中,常用ELISA方法进行不同批次或者长期稳定性样品的亲和力评价。亲和力一般来说是绝对值,但是由于生物实验的复杂性,材料批次的替换可能会影响到样品的亲和力检测准确性,常会引入一个默认质量属性不会变化的对照品作为参比品,待测样品和参比品一同进行检测来抵消材料造成的偏差,并计算待测样品相对于参比品的亲和力(相对结合活性)。



六、ELISA法之自省


6.1显色淡,灵敏度偏低

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6.2背景深,全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)

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6.3重复性不佳,高CV值

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6.4出现白板,阳性对照不显色

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参考文献

Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry.FDA,May 2018.

BERBIOANALYTICAL METHOD VALIDATION M10 draft February 2019.

《中国药典》2020年版 第四部-生物样品定量分析方法验证指导原则